Pruduzzione è caratterizazione biochimica di a laccasi di funghi ostrica NRC 620 è valutazione di a so efficienza in a chiarificazione di u suchju di mela.

Dopu à 25 ghjorni d'incubazione statica à 28°C, a laccasi di *Pleurotus ostreatus* NRC620 hà mostratu a più alta attività in u mezu di cultura fungina. I valori ottimali di pH è temperatura per questu enzima eranu 3,0 è 70°C, rispettivamente. Dopu à 2 ore d'incubazione à 40°C è 50°C, l'attività enzimatica hè stata mantenuta rispettivamente à 68,33% è 59,61%. Dopu à 2 ore d'incubazione in tampone citrato-fosfato (pH 7,0), l'attività enzimatica hè rimasta à 100%. L'aghjunta di 10 mM MgSO₄ è CuSO₄ hà aumentatu l'attività enzimatica di circa 21% è 35%, rispettivamente, mentre chì NaCl, MnCl₂, KCl è CaCl₂ anu inibitu l'attività enzimatica. Utilizendu ABTS cum'è substratu, i parametri cinetichi (Km è Vmax) di a laccasi *Pleurotus ostreatus* NRC 620 eranu 1,99 mM è 16.217 μmol min−1 L−1, rispettivamente. U trattamentu enzimaticu di i campioni di suchju di mela hà riduttu significativamente sia u pH sia a viscosità, è sta riduzione hè stata correlata cù un aumentu di u tempu di conservazione. U trattamentu cù laccasi hà risultatu in una ligera diminuzione di u cuntenutu fenolicu tutale di u suchju di mela, ma ùn hè stata osservata alcuna riduzione di l'attività antioxidante.
In l'ultimi anni, i circadori si sò cuncentrati nantu à l'applicazione di a biotecnologia verde in l'industria alimentaria. A laccasi hè unu di l'enzimi i più utili in l'industria alimentaria, chì trova applicazioni in settori cum'è a trasfurmazione di suchji, a panificazione, a stabilizazione di u vinu è u miglioramentu di e qualità organolettiche di i prudutti alimentari.¹Parechje piante superiori è microorganismi secernunu laccasi,²è i funghi cum'è i deuteromiceti, l'ascomiceti è i basidiomiceti ponu ancu pruduce laccasi.³A laccasi (EC 1.10.3.2) hè una ossidasi blu chì riduce l'ossigenu moleculare in acqua aduprendu un sistema custituitu da trè atomi di rame diversi, ossidendu cusì diversi cumposti fenolici è amine aromatiche. Durante a pruduzzione di suchji di frutta è verdura, l'imbrunimentu enzimaticu è non enzimaticu sò prublemi critichi.⁴Siccomu ste sustanze affettanu negativamente u culore, u sapore è l'aroma di u suchju, devenu esse eliminate.⁵
Di tutti i frutti, e mele sò e più cunsumate in u mondu sanu è in l'Unione Europea. In u 2019, a pruduzzione di mele hè stata classificata terza à u livellu mundiale, superendu l'87 milioni di tunnellate.⁶E mele cuntenenu numerosi cumposti fenolichi, cumpresi flavonoidi è acidi fenolichi cum'è l'acidu caffeicu è l'acidu clorogenicu.⁷Siccomu u suchju di mela hè tipicamente cunsumatu in a so forma chjara, circa u 50% à u 90% di i cumpunenti fenolici si perdenu durante u prucessu di filtrazione.⁸Oghje, i cunsumatori tendenu à sceglie prudutti minimamente trasfurmati, cum'è u suchju di mela torbidu cù un altu cuntenutu di polifenoli. Tuttavia, per via di u so altu cuntenutu fenolicu, questu tipu di suchju di mela hè particularmente suscettibile à a decolorazione è à l'oscuramentu.⁹Diverse tecnulugie, cumpresi i metudi di trattamentu termicu cum'è a pasteurizazione à 60-90 ° C, sò aduprate per riduce o impedisce l'oscurità di u suchju di mela.¹⁰Tuttavia, secondu a ricerca di Sauceda-Gálvez¹¹, u trattamentu termicu pò distrughje i prudutti chimichi volatili è influenzà e qualità organolettiche di u suchju di mela. L'alternative à i metudi di trattamentu termicu includenu u diossidu di carbonu supercriticu, a radiazione ultravioletta, l'ultrasoni, l'alta pressione idrostatica o l'omogeneizazione à alta pressione.¹²L'efficienza di ste tecnulugie è u rendimentu di suchji di frutta adatti dipendenu da i parametri utilizati è da e caratteristiche di u produttu. U so usu diffusu hè limitatu da costi elevati, effetti negativi nantu à a qualità di certi prudutti alimentari, o inattivazione enzimatica inadeguata.^13,14
A laccasi pò esse aduprata per stabilizà è chiarificà u suchju di frutta.¹⁵Gökmen et al.¹⁶ricumandenu l'usu di laccasi per a chiarificazione di u suchju di frutta perchè elimina efficacemente i cumposti fenolici cunvertenduli in polimeri o oligomeri chì sò facilmente eliminati da qualsiasi membrana di ultrafiltrazione, permettendu à u suchju di mela di mantene un culore è una chiarezza stabili finu à sei settimane à 50 ° C. A laccasi purificata * Trichoderma * hè stata immobilizzata nantu à perle d'alumina è aduprata per eliminà selettivamente i cumposti di sapore sgradevole causati da a contaminazione microbica di u suchju di mela.¹⁷
Circa 80-90% di i cumpunenti volatili di u suchju di mela sò esteri è aldeidi, chì danu un aroma unicu à u suchju.¹⁸A laccasi di *Trametes versicolor* hè stata immobilizzata nantu à un supportu pocu costoso fattu di fibra naturale da giovani gusci di noce di cocco per a clarificazione di u suchju di mela.¹⁹Studi precedenti anu investigatu a stabilizazione di u suchju di mela (culore è turbidità) aduprendu metudi senza enzimi o d'immobilizazione, o in cumbinazione cù l'ultrafiltrazione.^5,19Tuttavia, l'effettu di e laccasi fungine nantu à e proprietà fisico-chimiche di u suchju di mela durante a conservazione ùn hè micca chjaru. Dunque, u scopu di questu studiu era di investigà sperimentalmente i cambiamenti in e proprietà fisico-chimiche, u cuntenutu di cumposti fenolici è l'attività antioxidante di u suchju di mela dopu u trattamentu cù laccasi fungine è a conservazione in frigorifero di duie settimane. E laccasi anu a capacità di ossidà i cumposti fenolici, ciò chì li rende promettenti per l'usu in vari prucessi industriali, cumprese a chiarificazione di u suchju. Questu studiu hà esaminatu e laccasi di *Pleurotus ostreatus* NRC 620, fucalizendu nantu à e cundizioni ideali per a so attività è efficacia in a chiarificazione di u suchju. Mentre a ricerca nantu à i funghi ostrica (P. ostreatus NRC 620) hè sempre limitata, studii precedenti anu esaminatu enzimi da varie fonti fungine, cum'è Trametes versicolor è Ganoderma lucidum. U scopu di questu studiu era di valutà l'applicazione putenziale di questu enzima in l'industria alimentaria è di mette in risaltu e so proprietà uniche, in particulare u so pH è a so temperatura ideali.
L'acidu 2,2′-Azooxybis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonicu) (ABTS) hè statu acquistatu da Sigma-Aldrich (Canada). Tutti l'altri reagenti eranu di qualità analitica.
U Centru di Raccolta di Culture Microbiane di u Centru Naziunale di Ricerca hà ottenutu a ceppa di funghi ostrica NRC620 cunnisciuta. Dopu a subcultura, sta ceppa hè stata cunservata nantu à piastre inclinate di agar destrosio di patata à 4 ° C. U metudu di preparazione di l'inoculu era u seguente: u miceliu cumpletamente sviluppatu di 10 ghjorni hè statu inoculatu nantu à piastre di agar destrosio di patata è incubatu à 28 ° C. Dopu à 10 ghjorni, trè blocchi miceliali di 12 mm di diametru sò stati rimossi da u mezu di cultura agar utilizendu un punzone metallicu sterile è posti in matracci Erlenmeyer di 250 mL cù tappi di cuttone chì cuntenenu 50 mL di mezu di cultura sterilizatu (pH 5.0, cum'è descrittu prima da Othman et al.²⁰). E culture sò state incubate à 28 °C per 18 ghjorni. E culture sò state poi filtrate attraversu carta da filtru Whatman n. 1, è u surnatante risultante hà servitu cum'è fonte d'enzima.
L'attività di laccasi hè stata determinata aduprendu ABTS cum'è substratu. A mistura di reazione (2 mL) cuntene 500 μL di 0,3 mM ABTS (dissoltu in un buffer di citratu di sodiu 0,1 M, pH 4,5) è a quantità necessaria di campione d'enzima diluitu cù acqua distillata.^21,22Cunsiderendu chì a laccasi pò ossidà l'ABTS à temperatura ambiente (28 °C ± 2), l'ossidazione di l'ABTS hè stata determinata misurendu l'aumentu di l'assorbanza à 420 nm (ε₄₂₀= 36.000 cm^-1 M ^-1) aduprendu un spettrofotometru UV Agilent Carry-100. Era necessaria un'unità di attività laccasi per ossidà 1 μmol ABTS per minutu. A cuncentrazione di proteine ​​hè stata determinata da u metudu Bradford aduprendu l'albumina di serum bovinu cum'è cuntrollu internu.^23,24
Dopu avè ottenutu l'enzima da a ceppa di fungu ostrica NRC 620, a so attività hè stata misurata à diversi intervalli di cultura per 25 ghjorni in cundizioni statiche à 28 °C.
Per studià l'effettu di a temperatura nantu à l'attività di a laccasi, l'esperimenti sò stati realizati in a gamma di temperature da 20 à 90 °C. Prima di aghjunghje l'enzima è di inizià a reazione, u buffer (0,1 M citratu di sodiu, pH 4,5) è u substratu (ABTS) sò stati mischiati è incubati per 5 minuti à diverse temperature. A stabilità termica di l'enzima hè stata valutata per incubazione in buffer fosfatu di sodiu 0,05 M (pH 7,0) à 40, 50, 60 è 70 °C per 2 ore, rispettivamente. L'attività residuale hè stata poi valutata utilizendu u substratu ABTS.
L'effettu di u pH nant'à l'attività di a laccasi hè statu valutatu aduprendu ABTS cum'è substratu in buffer citratu-fosfatu 0,1 M cù un intervallu di pH da 2,5 à 7,0. A suluzione enzimatica hè stata incubata à 40 °C per duie ore in buffer citratu è Tris 0,1 M (pH 3, 4, 6 è 7) per valutà a stabilità di u pH. L'attività residuale cù ABTS cum'è substratu hè stata calculata dopu l'incubazione.
A laccasi hè stata incubata per 10 minuti in un buffer di fosfatu di sodiu (0,05 M, pH 7,0) chì cuntene diversi ioni metallichi (Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+, è Mn2+) à cuncentrazioni di 2,5 mM è 10 mM, rispettivamente. U substratu (ABTS) hè statu dopu aghjuntu per inizià a reazione, è l'attività relativa hè stata valutata.
L'ossidazione di l'ABTS da a laccasi à diverse concentrazioni (0,025-3 mM) hè stata misurata à pH 4,5 per determinà i parametri cinetichi (Vmax è Km). A cinetica^custantidi l'equazione di Michaelis-Menten sò state calculate aduprendu un graficu di Lineweaver-Burk, chì traccia u reciprocu di a velocità di reazione in funzione di a cuncentrazione di u substratu. E custanti cinetiche sò state calculate da u graficu di Lineweaver-Burk aduprendu u software GraphPad Prism versione 6.01.
Dopu avè lavatu accuratamente e mele cù l'acqua di u rubinettu, sò state tagliate à a mità è spremute cù un spremiagrumi Braun MP80 cumpletamente automaticu (fabbricatu in Germania). U suchju hè statu filtratu attraversu quattru strati di garza. Nisun enzima hè statu aghjuntu à u gruppu di cuntrollu, mentre chì 2,0% di laccasi (a cuncentrazione più efficace testata) hè stata aghjunta à u suchju di mela appena preparatu, chì hè statu poi cunservatu à 4 ° C per duie settimane.
L'acidità titrabile (TA) è u pH sò stati determinati secondu u metudu di Boulton et al.^al.27U pH di ogni campione hè statu misuratu cù un pH-metru digitale (pH-metru JENWAY 3510). L'acidità titrabile (TA) hè stata calculata basendu si nantu à l'acidu malicu aduprendu a formula seguente.
Induve V è C sò rispettivamente u vulume (mL) è a cuncentrazione (0,1 mol/L) di a suluzione d'idrossidu di sodiu aduprata in a titrazione. K hè u coefficientu di cunversione di l'acidu malicu, uguale à 0,067, è W hè a massa (g) di suchju di mela.
I solidi solubili totali (^TDS) u cuntenutu di tutti i campioni di suchju hè statu determinatu cù un rifrattometru tascabile PAL-1 (ATAGO, Tokyo, Giappone). Dopu ogni misurazione, a lente ottica hè stata sciacquata cù acqua deionizzata, è ogni campione di suchju di mela hè statu testatu trè volte. U valore per ogni campione hè statu calculatu facendu a media di e trè misurazioni. A media ± deviazione standard per ogni campione di suchju di mela hè stata ancu calculata facendu a media di sti risultati.
A viscoelasticità di i campioni di suchju di mela hè stata valutata cù un viscosimetru rotazionale (RV, Rheotest 2, Germania). U campione hè statu piazzatu in u cilindru "S2" di u viscosimetru. A viscosità apparente era rapprisintata da a pendenza di a curva di tensione di taglio versus velocità di taglio, chì hè stata calculata da a tensione di taglio è e curve currispondenti à diverse velocità di taglio (da 1,00 à 437,4 s⁻¹). A formula per calculà a viscosità apparente hè a seguente:
Induve η hè a viscosità apparente (cP), τ hè a tensione di taglio (dyn/cm²), γ hè a velocità di taglio (sec⁻¹), è (τ) hè calculatu aduprendu i valori di coppia (α) è di cilindru (Z) aduprendu a seguente formula: τ = Z . α.
L'indice di brunitura hè statu determinatu secondu u metudu di Meidav ​​​​et^al.29Un campione di suchju di 10 ml hè statu centrifugatu à 2750 xg per 10 min. 5 ml di u surnatante di suchju hè statu mischiatu cù 5 ml di etanolu à 95%. L'assorbanza di a mistura hè stata misurata à 420 nm aduprendu un spettrofotometru UV Shimadzu (UV-1601 PC).
U cuntenutu fenolicu tutale (TPC) hè statu determinatu culurimetricamente aduprendu u reagente Folin-Ciocalteu cum'è descrittu da Boulton et al.^[27]. Una curva standard di l'acidu gallicu hè stata custruita per cuncentrazioni da 0 à 500 mg/L (^r²= 0,997). I risultati sò espressi cum'è equivalenti d'acidu gallicu (mg GAE/mL).
Aghjunghjite 125 μL d'acqua distillata è 2850 μL di suluzione FRAP à 25 μL di suchju di mela è lasciate u mischju à u bughju per³⁰min. Dopu, misurate l'assorbanza à 593 nm cù un spettrofotometru UV Shimadzu (UV-1601 PC). U reagente FRAP hè statu preparatu mischjendu 300 mM di tampone acetatu (pH 3,6), 20 mM di cloruru di ferru (III) è 10 mM di 2,4,6-tris (2-piridil) triazina (TPTZ) (dissolta in 40 mM HCl) in un rapportu di 10: 1: 1. Una curva standard hè stata generata aduprendu Trolox cum'è standard (^R²= 0,999), è i risultati sò espressi cum'è μM Trolox/mL.
L'attività antioxidante di i suchji trattati è micca trattati hè stata determinata aduprendu u metudu DPPH per valutà a so capacità di eliminà i radicali liberi DPPH.³¹Deci microlitri di suchju sò stati mischiati cù 1 ml di una suluzione DPPH (100 μM) in metanolu. Dopu a reazione à u bughju per 30 minuti, l'assorbanza di a mistura hè stata misurata à 517 nm aduprendu un spettrofotometru UV Shimadzu (UV-1601 PC). I risultati sò stati espressi cum'è equivalenti trolox (μM trolox/ml) basati annantu à una curva di calibrazione (_^R2= 0,990).
I dati ottenuti anu dimustratu chì a pruduzzione massima di laccasi hè stata osservata in i funghi ostrica NRC 620 à a fine di u 18esimu ghjornu di fermentazione, righjunghjendu una attività di 1302 U/L. Questu hà servitu cum'è basa per determinà u tempu di cultura ottimale per a pruduzzione di laccasi (Figura 1). Ancu s'è a pruduzzione di enzimi hè aumentata cù l'aumentu di u tempu di cultura, u ritmu di aumentu ùn era micca direttamente proporzionale à u tempu di cultura; dopu à 21 ghjorni, l'attività di l'enzimi era aumentata solu di 90 U/L (à 1390 U/L). Dunque, 18 ghjorni sò stati infine scelti cum'è u tempu di cultura ottimale per equilibrà u rendimentu di u produttu cù i benefici ecunomichi di l'aumentu di u tempu di cultura.
Effettu di u tempu di cultura nantu à u rendimentu di laccasi in Pleurotus ostreatus NRC 620. Trè blocchi miceliali fungini (12 mm) sò stati inoculati in 50 ml di mezu sterile è dopu cultivati ​​à 28 °C per tempi diversi.
In cunfurmità cù altri studii, i nostri risultati indicanu chì u periodu di cultura ideale per ottene u piccu di secrezione di laccasi da i funghi hè prubabilmente trà 7 è 36 ghjorni.³²Sicondu Ezike et al.³³, *Trametes polyzona* WRF03 hà pruduttu a più alta quantità di laccasi à a fine di u nonu ghjornu di fermentazione, cù una attività specifica di 1637 U/mg di proteina. Inoltre, Othman et al.³⁴anu scupertu chì *Trichoderma harzianum* S7113 secretava una grande quantità di laccasi u quintu ghjornu di cultura. U ritmu di pruduzzione di laccasi hà righjuntu un piccu di attività u quattordicesimu ghjornu è dopu hè diminuitu gradualmente.³⁴Ancu s'è a secrezione di l'enzimi pò ancu accade durante a fase principale di crescita, di solitu righjunghje u so piccu durante a fase intermedia è hè scatenata da u cunsumu di una fonte di carbone o d'azotu.^34,35
Ancu s'è a laccasi di Pleurotus ostreatus NRC 620 hà mostratu una alta attività in un vastu intervallu di temperature da 50 °C à 80 °C, avvicinendu si à u piccu di attività (69-98%), a so attività massima hè stata osservata à 70 °C (Fig. 2a). Fora di questu intervallu di temperature, l'attività enzimatica hè diminuita à circa 70 °C. Quessi risultati suggerenu chì l'enzima hè attivu à alte temperature, probabilmente perchè l'alta temperatura aumenta l'energia cinetica di a reazione.
Effettu di a temperatura di reazione (a) è di u pH (b) nantu à l'attività di a laccasi in *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Temperature chì varianu da 20 à 90 °C sò state ottenute preincubendu a mistura à diverse temperature per 5 minuti prima di aghjunghje l'enzima è inizià a reazione. L'effettu di u pH nantu à l'attività di a laccasi hè statu valutatu aduprendu ABTS cum'è substratu in suluzioni chì cuntenenu 0,1 M di tampone citrato-fosfatu in un intervallu di pH da 2,5 à 7,0.
Sicondu Ezike et al.^al.33, a temperatura ottima per a laccasi *Trametes polyzona* WRF03 hè 55 °C, chì hè a listessa chè quella per *Ganoderma lucidum*^laccase36è simile à a temperatura ottima (50 °C) per *Trametes polyzona* KU-RNW02737^laccasi . ^Baldrian38nota chì, cum'è per altri sistemi enzimatici chì degradanu a lignina, l'intervallu di temperatura ideale per a laccasi hè trà 50 è 70 °C.
I risultati anu dimustratu chì l'enzima hà mostratu a più alta attività à pH 3.0, righjunghjendu 94% di attività à pH 3.5. Tuttavia, hè restatu attivu in un largu intervallu di pH da 2.5 à 7.0 (Figura 2b). Inoltre, hà mostratu una attività più alta in cundizioni acide paragunatu à e cundizioni neutre o alcaline. A so attività hè rimasta almenu 77% in l'intervallu di pH da 2.5 à 4.5, ma hà righjuntu solu circa 38% à pH 7.0. U pH ottimale per a laccasi di *Trametes polyzona* WRF03 era 4.533, chì hè u listessu chè u pH per e laccasi di *Trametes polyzona* KU-RNW02737, *Trichoderma harzanium* 39, *Pleurotus* sp. 40, è *Trametes hirsuta* 41. Tuttavia, secondu u studiu di Chairin et al.⁴², u pH ottimale per a laccasi di *Polymorpha f. sp.* WR710-1 hè 2,2, mentre chì u pH ottimale per a laccasi di *Polymorpha f. sp.* IBL-04 hè 5,043. U ligame di l'anioni idrossidu (inibitore di laccasi) à l'atomi di rame di a laccasi T2/T3 pò esse a ragione di a diminuzione di l'attività di a laccasi in cundizioni di pH neutru o alcalinu. Questu pò interrompe u trasferimentu internu di elettroni da u centru T1 à u centru T2/T3, cusì^limitazionel'attività enzimatica23,44
Incubendu l'enzima à diverse temperature, hè statu scupertu chì sia u tempu d'incubazione sia a temperatura anu affettatu a stabilità di l'enzima. In particulare, a laccasi di *Trametes polyzona* NRC 620 hà mostratu una stabilità più alta à 40℃ è 50℃, mantenendu rispettivamente u 68,33% è u 59,61% di a so attività iniziale, dopu à 120 minuti (Figura 3a). In cuntrastu, in e stesse cundizioni (40℃ è 50℃, 120 minuti), a laccasi di *Trametes polyzona* WRF03 hà mantenutu rispettivamente u 64,38% è u 42,92% di a so attività.³³À u cuntrariu, l'aumentu di u tempu d'incubazione è di a temperatura hà diminuitu a stabilità di a laccasi *Trametes polyzona* NRC 620; Dopu l'incubazione à 60℃ è 70℃ per 60 minuti, a so attività hè diminuita à 39,24% è 1,72%, rispettivamente (Figura 3a). In cunfurmità cù i risultati sperimentali, a laccasi di *Trametes polyzona* WRF03 hà mostratu una stabilità più alta à 40 è 50℃ durante tuttu u prucessu di trattamentu termicu.³³In listessu modu, Lueangjaroenkit et al.^al.37è Chairin et al.^al.42anu signalatu a stabilità di e laccasi da Trametes polyzona KURNW027 è Trametes polyzona WR710-1 à 50 °C per 1 ora, rispettivamente. Cum'è un biocatalizatore utile applicabile in diversi campi biotecnologichi, a laccasi deve avè una bona stabilità è prestazioni in un largu intervallu di temperature.
Stabilità termostatica (a) è stabilità di u pH (b) di a laccasi di *Pleurotus ostreatus* NRC 620. A stabilità termostatica hè stata valutata incubendu a suluzione enzimatica in un buffer fosfatu di sodiu 0,05 M (pH 7,0) à 40, 50, 60 è 70 °C per 2 ore, rispettivamente. A stabilità di u pH hè stata valutata incubendu a suluzione enzimatica in un buffer citratu 0,1 M è un buffer Tris (pH 3, 4, 6 è 7) à 40 °C per 2 ore. L'attività residuale hè stata calculata aduprendu ABTS cum'è substratu dopu l'incubazione.
Per determinà e cundizioni ottimali per l'usu è u almacenamentu di l'enzimi, avemu investigatu l'effettu di u pH nantu à a stabilità di a laccasi. L'esposizione à diversi valori di pH hà influenzatu significativamente a stabilità di a struttura di a proteina, influenzendu cusì a stabilità è l'attività di a molecule di l'enzima. I risultati anu dimustratu chì l'enzima era menu stabile in cundizioni acide, mentre chì hà dimustratu una migliore stabilità à valori di pH più alti (regioni neutre è alcaline). À valori di pH di 7,0, 6,0, 4,0 è 3,0, i tassi di ritenzione di l'enzima dopu à 120 minuti eranu circa 100%, 62,54%, 52,39% è 11,14%, rispettivamente (Fig. 3b). A laccasi *Strombus multisus* WRF03 hà dimustratu una maggiore stabilità à valori di pH neutri (5,5-6,5) è una minore stabilità à valori di pH acidi (sottu à 4,0). Dopu à 120 minuti à valori di pH di 5,5, 6,0 è 6,5, i tassi di ritenzione di l'enzima eranu rispettivamente di circa 82%, 100% è 93%.³³Khairin et al.⁴²anu nutatu chì a laccasi di Trametes polyzona WR710-1 era stabile in u range di pH da 6,0 à 7,0, mentre chì Sayed et al.⁴⁵hà dimustratu chì a laccasi era più stabile in cundizioni di pH neutru. Tuttavia, a laccasi di Cerrena unicolor hà ancu mostratu stabilità in cundizioni alcaline (pH 9.0)⁴⁶E laccasi studiate anu dimustratu una alta stabilità in un vastu intervallu di pH. Questa pò esse una caratteristica impurtante per l'applicazioni industriali.
Siccomu certi ioni metallichi anu effetti sia stimulanti sia inibitori nantu à l'attività enzimatica, i so effetti nantu à l'attività enzimatica devenu esse presi in cunsiderazione in l'applicazioni industriali. Questu hè cruciale perchè l'ioni metallichi sò contaminanti ambientali cumuni chì ponu influenzà a stabilità è a sintesi di l'enzimi extracellulari.⁴⁷Per investigà l'effetti di parechji ioni metallichi nantu à a laccasi di *Pleurotus ostreatus* NRC 620, avemu realizatu esperimenti currispondenti. Cum'è mostratu in a Figura 4, secondu u tipu di metallu utilizatu, l'aumentu di a cuncentrazione di ioni metallichi da 2,5 mM à 10 mM hà influenzatu negativamente a funzione enzimatica. Per esempiu,^Mg²⁺ , ^Co²⁺ , ^Zn²⁺, è^Cu²⁺puderia stimulà è attivà l'attività enzimatica, mentre^Na⁺ , ^Mn²⁺ , ^Ca²⁺, è^K⁺puderia inibisce l'attività enzimatica. À una cuncentrazione di 10 mM, l'ioni Cu²⁺ è Mg²⁺ eranu l'attivatori più putenti di l'attività laccasica da *Pleurotus ostreatus* NRC 620, furnendu un gradu di attivazione di circa 34% è 20%, rispettivamente. Tuttavia, à una cuncentrazione di 10 mM, l'ioni Ca²⁺ eranu l'inibitore più putente di a laccasica, riducendu l'attività enzimatica di circa 60%.
L'effettu di l'ioni metallichi nantu à l'attività di a laccasi Pleurotus ostreatus NRC 620. A laccasi hè stata incubata per 10 minuti in un buffer di fosfatu di sodiu (0,05 M, pH 7,0) chì cuntene diversi ioni metallichi à cuncentrazioni di 2,5 mM è 10 mM. A reazione hè stata tandu iniziata da l'aghjunta di u substratu (ABTS), dopu à quale hè stata misurata l'attività relativa.
I nostri risultati sò coerenti cù quelli d'altri autori chì anu trovu chì Mg²⁺ è Cu²⁺ aumentanu l'attività di *Trametes polyzona* WRF03³. Castaño et al.⁴⁸ anu trovu chì a laccasi di *Xylaria* sp. hè stimulata in una certa misura da l'ioni di rame (Cu²⁺). Inoltre, Foroutanfar et al.⁴⁹ è Si et al.⁵⁰ anu realizatu studii simili nantu à e laccasi di *Paraconiothyrium variabile* è *Trametes pubescens*, rispettivamente. U situ di legame di u rame di tipu II (T2) di questu enzima pò esse saturatu cù Cu²⁺ à una data cuncentrazione, ciò chì pò spiegà a stimulazione di l'attività di a laccasi à cuncentrazioni più elevate di Cu²⁺³⁹. Siccomu e laccasi di i funghi di a putrefazione bianca sò ossidasi chì cuntenenu parechji atomi di rame, l'effetti di l'ioni di rame nantu à l'attività di a laccasi sò diversi è varianu da stimulanti è inibitori à neutri.⁵¹ In cuntrastu, Zhou et al.^[52]hà dettu chì^Cu²⁺hà inibitu l'attività laccasica di a termite sutterranee di Taiwan (Odontotermes formosanus). Tuttavia, e laccasi di Cerena sp. HYB07^[53]è Clitocybe maxima^[54]ùn sò stati affettati da ioni di rame.
A specificità di u substratu era rapprisintata da i so parametri cinetichi (Km è Vmax); più forte hè l'affinità di ligame di u substratu à l'enzima, più bassu hè u valore Km è più alta hè a specificità di u substratu.^3,21,55I parametri cinetichi (Km è Vmax) di a laccasi di *Pleurotus ostreatus* NRC 620 sò stati determinati cù u software GraphPad Prism 6.0 tracciendu u graficu di Lineweaver-Burk (Figura 5). Quandu si usa ABTS cum'è substratu, i risultati sò stati 1,99 mM è 16217 μmol^{min⁻¹ L⁻¹,}rispettivamente. Elsayed et al.²¹anu signalatu chì i valori di Km per l'ossidazione di ABTS eranu 0,1 mM è 0,064 mM, rispettivamente, ciò chì indica una alta affinità di l'isoenzimi Lac A è Lac B per ABTS. Inoltre, i valori di Vmax eranu 0,182 μmol^min⁻¹è 0,603 μmol^min⁻¹, rispettivamente. U valore Km ottenutu era più bassu di quellu di Trametes polyzona WRF03 (8,66 mM); inoltre, u so valore Vmax (1429 mmol min⁻¹) era ancu^{più bassu}quandu si usa ABTS cum'è substratu.33 In listessu modu, i valori Km di Lentinus squarrosulus MR13 è Trametes sp. AH28-2 concentrazioni di laccasi eranu 0,0714 mM è 0,025 mM, rispettivamente, è i valori Vmax eranu 0,0091 mM min−1 è 0,67 mM min−1 mg−1 (relativu à ABTS)^{, rispettivamente.56,57}
L'effettu di a cuncentrazione d'ABTS nant'à l'attività di a laccasi di *Pleurotus ostreatus* NRC 620 hè statu investigatu, è hè statu tracciatu un graficu di Lineweaver-Burk di u reciprocu di a velocità di reazione iniziale versus a cuncentrazione d'ABTS. A reazione d'ossidazione di ABTS cù diverse cuncentrazioni (0,025-3,0 mM) di laccasi hè stata misurata à pH 4,5 per determinà i parametri cinetichi (Vmax è Km). E custanti cinetiche di Michaelis-Menten sò state calculate utilizendu u graficu di Lineweaver-Burk di u reciprocu di a velocità di reazione versus a cuncentrazione di u substratu. E custanti cinetiche sò state calculate da u graficu di Lineweaver-Burk utilizendu u software GraphPad Prism 6.01.
L'enzimi tradiziunali di chiarificazione, cum'è e pectinasi, idrolizanu e sustanze pectiche, riducendu a viscosità è a turbidità. Decomponenu efficacemente i polisaccaridi strutturali è sò spessu aduprati in cumbinazione cù altri enzimi, cum'è e cellulasi è l'emicellulasi, per migliurà u rendimentu è a chiarezza. Tuttavia, e pectinasi ùn miranu micca specificamente i cumposti fenolici, chì sò i principali cuntributori à a turbidità è à l'imbrunimentu ossidativu, in particulare in suchji cum'è u suchju di mela è d'uva.⁵⁸À u cuntrariu, e laccasi catalizanu l'ossidazione di i cumposti fenolici, polimerizenduli in molecule più grande è insolubili chì ponu esse eliminate per sedimentazione o filtrazione. Stu mecanismu ùn solu migliora a chiarezza, ma allunga ancu a durata di conservazione di u suchju riducendu a probabilità di imbrunimentu ossidativu causatu da i cumposti fenolici. Inoltre, i prucessi di chiarificazione basati nantu à a laccasi ponu esse realizati in cundizioni di trasfurmazione moderate (pH 3,5-5,5, temperatura 25-40 °C), rendenduli adatti per suchji delicati senza compromettere e so proprietà nutrizionali o organolettiche.⁵⁹Studi anu dimustratu chì u trattamentu cù pectinasi pò chiarificà u suchju in 1-2 ore, mentre chì u trattamentu cù laccasi richiede tipicamente un tempu di reazione più longu (3-6 ore) per riduce cumpletamente i cumposti fenolici. Tuttavia, stu prucessu pò esse ottimizatu immobilizendu l'enzima o cumbinendu a laccasi cù metudi di chiarificazione meccanica.⁶⁰In questu studiu, a prufilatura enzimatica di l'estrattu crudu hà rivelatu attività significative di laccasi è α-amilasi, mentre chì l'attività di pectinasi è xilanasi eranu estremamente basse, è l'attività di cellulasi ùn hè stata rilevata. Dunque, a riduzione di a turbidità è di u cuntenutu fenolicu era principalmente dovuta à l'azione di a laccasi, mentre chì u cambiamentu di viscosità puderia esse in parte dovutu à l'azione di l'amilasi.
A tavula 1 mostra i parametri fisicochimichi di u suchju di mela appena spremutu è di i campioni trattati cù laccasi. I risultati anu dimustratu chì u rendimentu di u suchju di mela appena spremutu (71,59%) era più bassu di quellu di i campioni trattati cù laccasi (87,34%). Quessi risultati sò coerenti cù i risultati di Pilnik è Orange.⁶¹, chì hà indicatu chì l'usu di enzimi in a trasfurmazione di frutti pò aumentà u rendimentu di suchju, migliurà a filtrazione è ottene un suchju chjaru di alta qualità per a cuncentrazione. L'aumentu di u rendimentu di suchju hè principalmente duvutu à l'aumentu di u cuntenutu di zuccheri solubili in u suchju. Durante l'idrolisi enzimatica di i frutti, a mesoglea è a pectina in i muri cellulari di u pruduttu sò distrutte è cunvertite in sustanzi solubili cum'è zuccheri neutri è acidi.^{62 .}U valore di pH di u suchju di mela trattatu cù enzimi era significativamente più bassu di quellu di u gruppu di cuntrollu (P < 0,05), è u valore di pH di i dui gruppi hè aumentatu significativamente durante a conservazione (Tabella 1). Quessi risultati sò coerenti cù quelli di Mark et al.⁶³, chì anu nutatu chì u pH di u suchju di frutti di cajou hè diminuitu dopu à a cunservazione dopu à u trattamentu termicu. A degradazione di a pectina è a furmazione di l'acidu galatturonicu dopu à u trattamentu enzimaticu ponu esse rispunsevuli di l'aumentu di u pH durante a cunservazione. U pH di i campioni trattati cù enzimi hè restatu trà 4,05 è 4,31 durante a cunservazione, mentre chì u pH di u suchju di mela micca trattatu variava trà 4,12 è 4,33.
L'acidità tutale (TA) di i campioni micca trattati è trattati cù laccasi hà mostratu una tendenza à a diminuzione cù l'aumentu di u tempu di conservazione (Tavula 1). A diminuzione di l'acidità hè stata attribuita à a cunversione di l'acidi organici in carboidrati o à reazioni enzimatiche, è ancu à l'ossidazione durante a conservazione di u suchju.⁶⁴L'acidità tutale di u suchju di mela di cuntrollu è di i campioni trattati cù enzimi era più bassa chè quella di l'altri suchji (suchju di fragola 0,9%, suchju di prugna 2,2%, suchju di kumquat 1,0%, suchju d'albicocca 2,4%, suchju d'aranciu 0,8%), ma simile à quella di l'altri suchji (per esempiu, suchju di pera 0,3%).⁶²Queste differenze in u suchju di mela appena spremutu senza trattamentu ponu esse dovute à diversi fattori cum'è e cundizioni di crescita, i fattori genetichi, u livellu di maturità è i metudi di trasfurmazione.⁶⁵A diminuzione di l'acidità tutale di u suchju di mela di cuntrollu è trattatu cù laccasi hè coerente cù i risultati presentati da Singh et al.⁶⁶riguardu à a diminuzione di l'acidità tutale di u suchju di mela Jin Nuo dopu à 74 ghjorni di almacenamentu. Da l'altra parte, Oshmiansky è Wojdylo⁶⁷ùn anu trovu cambiamenti significativi in ​​l'acidità di u suchju di mela quandu anu studiatu l'effettu di i metudi tradiziunali di chiarificazione.
I risultati prisentati in a Tavula 1 indicanu chì u valore di i solidi solubili totali (TSS) di u suchju di mela trattatu cù laccasi era più altu ch'è quellu di u campione micca trattatu. Quessi risultati sò coerenti cù i studii publicati.^{. 68}Inoltre, a Tavula 1 mostra chì u valore TSS di u gruppu di suchju di mela di cuntrollu era 9,58 à u puntu di tempu iniziale è hà righjuntu 11,05 à a fine di u periodu di conservazione. Quessi valori sò più bassi di i valori TSS di u suchju di mela frescu riportati da Hamid et al.^{. 69}(11,2 è 11,80, rispettivamente). U valore TSS di i campioni di suchju di mela trattati cù laccasi hè aumentatu significativamente, partendu da 11,23 è righjunghjendu 12,93 dopu à duie settimane di almacenamentu à 4 ° C (Tavula 1). Un aumentu simile di TSS durante u almacenamentu hè statu osservatu ancu in agrumi, limoni è aranci dolci. L'aumentu di i solidi totali solubili (TSS) durante u almacenamentu pò esse duvutu à l'idrolisi di polisaccaridi (amidu) in monosaccaridi (zuccheri), l'aumentu di a cuncentrazione per via di a disidratazione di u suchju è a degradazione di a pectina in u suchju in solidi solubili. L'aumentu di i solidi totali solubili (TSS) hè probabilmente duvutu à l'aumentu di i zuccheri solubili, chì ponu esse furmati da a cunversione di pectina o cellulosa in zuccheri solubili da pectina o cellulasi, rispettivamente, o da l'idrolisi di l'amidu in zuccheri, cum'è riportatu da Hamed et al.^69.L'effettu di a laccasi nantu à e proprietà di u suchju di mela pò esse osservatu visivamente, postu chì u suchju di mela trattatu cù laccasi presenta una migliore fluidità è una viscosità più bassa cà u suchju micca trattatu. Questa osservazione hè registrata in a Tavula 1; A viscosità di u campione trattatu cù enzimi era di 1,87 cP, mentre chì a viscosità di u campione di cuntrollu era di 2,95 cP. Questa diminuzione significativa di a viscosità hè probabilmente dovuta à a maggiore capacità di ritenzione idrica di e sostanze simili à a pectina è à a furmazione di una struttura di rete coesiva.
In questu studiu, l'effettu di a laccasi nantu à l'indice di imbrunimentu (BI) di u suchju di mela hè statu investigatu misurendu l'assorbanza à 420 nm cù un spettrofotometru. I risultati sò mostrati in a Tavula 1. Durante a conservazione, u BI di i campioni di suchju di mela in i gruppi trattati è micca trattati hà mostratu una tendenza graduale à cresce. U BI riflette u gradu di imbrunimentu è pò serve cum'è^{un impurtante}indicatore di reazzioni di imbrunimentu enzimatiche è non enzimatiche. L'assorbanza hè aumentata significativamente durante a conservazione (P < 0,05). À a fine di a conservazione, u_A420U valore di i campioni di suchju di mela in i gruppi di cuntrollu è trattati cù enzimi hè aumentatu rispettivamente di circa 217% è 121% (Tavula 1). I risultati indicanu chì u trattamentu enzimaticu pò riduce efficacemente u gradu di imbrunimentu di circa 56%. I risultati di Bezerra et al.^[19] sò coerenti cù i nostri risultati; Anu utilizatu laccasi-glutaraldeide-fibra di coccu per chiarificà u suchju di mela, riducendu u so culore originale di 61%.
Ancu s'è i polifenoli in i suchji di frutta anu effetti nutrizionali è terapeutichi pusitivi nantu à u corpu umanu, ponu ancu reagisce cù e proteine, pruvucendu torbidità, sedimentazione o turbidità di u suchju, alterendu cusì u sapore è l'aroma di u pruduttu è riducendu a so durata di conservazione.⁷¹L'obiettivu di stu studiu era di riduce in modu sicuru u cuntenutu di cumposti fenolichi di u suchju di mela aduprendu laccasi di Pleurotus ostreatus NRC 620. I risultati presentati in a Tavula 1 mostranu chì u cuntenutu tutale di cumposti fenolichi di u suchju di mela trattatu cù laccasi hè statu significativamente riduttu prima di a conservazione à 4 °C. Inoltre, u cuntenutu tutale di cumposti fenolichi hè ancu diminuitu durante a conservazione in i dui campioni studiati (Tavula 1). Ricerca di Sandri et al.⁷²hà dimustratu chì u suchju di mela trattatu cù enzimi pò mantene a so attività antioxidante è u so cuntenutu di cumposti fenolici. Tuttavia, i risultati di un studiu di Lettera et al.⁷³dimustranu chì u trattamentu di u suchju d'aranciu cù laccasi fungina pò riduce u cuntenutu di cumposti fenolici finu à u 45%.
I cumposti fenolici anu dimustratu di avè proprietà cum'è a eliminazione di i radicali liberi, a riduzione è u quenching di l'ossigenu singlettu, u trasferimentu di l'atomi d'idrogenu è a donazione di elettroni à i radicali liberi, ciò chì li rende putenti antioxidanti.⁷⁴Dunque, in questu studiu, i metudi basati nantu à DPPH è FRAP sò stati utilizati per valutà l'effettu di a laccasi nantu à l'attività antioxidante di u suchju di mela cunservatu in un frigorifero per 14 ghjorni (Tavula 2). Tramindui i metudi anu mostratu un aumentu di l'attività antioxidante durante a cunservazione, chì pò esse duvuta à l'aumentu di i cumposti fenolici liberi o à a furmazione di prudutti di reazione di Maillard (MRP), cù i prudutti di reazione di Maillard chì sò probabilmente a causa di l'aumentu di l'attività antioxidante.⁷⁵E reazzioni di imbrunimentu non enzimatiche (cumprese a degradazione di l'acidu ascorbicu, e reazzioni di Maillard è a degradazione di i zuccheri catalizzata da l'acidi) producenu pigmenti marroni (melanoidine). I prudutti intermedi di degradazione di l'acidu ascorbicu è i prudutti di degradazione di u zuccheru (cum'è i cumposti carbonilici) ponu reagisce cù l'aminoacidi per via di e reazzioni di Maillard.⁷⁶Ancu s'è l'imbrunimentu di frutti è ligumi durante a cunservazione hè statu studiatu ampiamente, a nostra capiscitura di ste reazzioni ferma limitata.⁷⁷In paragone cù u metudu FRAP, u suchju di mela trattatu cù laccasi hà mostratu una attività antioxidante significativamente più bassa cù u metudu DPPH (Tavula 2), è l'attività antioxidante di tutti i campioni hè aumentata significativamente cù l'aumentu di u tempu di conservazione. Dui metudi diffirenti per determinà l'attività antioxidante sò stati utilizati in questu studiu perchè i so principii sò diffirenti. U metudu DPPH misura a capacità di neutralizà i radicali liberi, mentre chì u metudu FRAP misura a capacità di riduce l'ioni di ferru. Dunque, hè cunsigliatu di utilizà parechji metudi per determinà l'attività antioxidante per capisce megliu l'attività antioxidante di i campioni studiati.⁷⁸
Unu di i principali risultati di questu studiu hè chì a laccasi *Pleurotus ostreatus* NRC 620 presenta un'attività ottima à 70°C è pH 3.0. In paragone cù altre laccasi fungine cumunemente aduprate per a chiarificazione di i suchji, cum'è e laccasi *Trametes versicolor* è *Ganoderma lucidum*, *P. ostreatus* NRC 620 presenta una maggiore stabilità termica è un pH più acidicu. E laccasi di *Trametes versicolor* è *Ganoderma lucidum* presentanu tipicamente un'attività ottima in l'intervallu di 50-60°C è à valori di pH trà 3.5 è 5.0. Questa differenza pò cuntribuisce à una migliore efficienza di chiarificazione di i suchji, in particulare per i suchji acidi induve a stabilità à valori di pH più bassi hè critica. A caratteristica unica di *P. In paragone cù altre laccasi fungine studiate, *Pleurotus ostreatus* NRC 620 presenta a capacità di funziunà efficacemente in cundizioni più difficili. A so temperatura d'attività ottimale più alta suggerisce vantaghji putenziali in l'applicazioni industriali, cum'è tassi di reazione più veloci è una contaminazione microbica ridotta. U so pH bassu, chì hè bè adattatu à a natura acida di parechji suchji, pò esse utile in i prucessi di chiarificazione di i suchji. Quessi risultati ghjustificanu un'ulteriore esplorazione per l'applicazione à grande scala, rendendu *Pleurotus ostreatus* NRC 620 una alternativa valida à e fonti tradiziunali di laccasi fungina. In paragone cù studii precedenti, avemu trovu chì a temperatura ottima hè 60°C è u pH ottimale hè 3,0. Dopu a reazione à 60°C per 80 minuti, a laccasi *Ganoderma lucidum* hè stata ritenuta.⁴⁶% di a so attività.79 Sicondu Kurniawati è Nicelle⁸⁰L'enzimi *Ganoderma lucidum* mostranu una stabilità eccellente à moderata à 25 °C è valori di pH chì varianu da 5,0 à 8,0, è stabilità à pH 6,0 è temperature chì varianu da 10 à 30 °C. In questu studiu, avemu trovu chì u pH è a temperatura ottimali per l'attività enzimatica per *Pleurotus ostreatus* eranu 3,0 è 70 °C, rispettivamente. Dopu l'incubazione à 40 °C è 50 °C per duie ore, l'enzima hà ritenutu rispettivamente u 68,33% è u 59,61% di a so attività. Inoltre, a laccasi Pleurotus ostreatus NRC 620 hà mostratu una alta attività in un vastu intervallu di temperature da 50 °C à 80 °C, righjunghjendu guasi l'attività massima (69%-98%), cù una attività massima osservata à 70 °C.
In cunclusione, a laccasi di funghi ostrica NRC620, ottenuta in cundizioni statiche, hà dimustratu una attività è una stabilità ottimali in una gamma di cundizioni di pH è temperatura, dimustrendu una stabilità superiore paragunata à altre fonti di enzimi. L'aghjunta di 10 mM MgSO₄ è CuSO₄ hà aumentatu l'attività enzimatica di circa 21% è 35%, rispettivamente. Quandu hè stata trasfurmata in suchju di mela, l'enzima hà riduttu u pH è a viscosità, mentre chì u cuntenutu fenolicu hè diminuitu solu ligeramente durante a conservazione.
I risultati cunfermanu u putenziale di a laccasi in l'industria alimentaria, in particulare in a chiarificazione di e bevande. Scomponendu specificamente i cumposti fenolici, a laccasi ùn solu riduce a turbidità è migliora a chiarezza, ma mantene ancu a qualità di i suchji di frutta in cundizioni operative moderate. À u cuntrariu di l'agenti chiarificanti tradiziunali cum'è a gelatina, a bentonite è u gel di silice, a laccasi ùn genera micca rifiuti nè elimina aromi piacevuli da e bevande, ciò chì a rende una opzione più rispettosa di l'ambiente è sustenibile. Inoltre, paragunata à altri enzimi è metudi di filtrazione, a laccasi offre una suluzione mirata è economica senza compromettere a qualità di u produttu.
Kyomuhimbo, HD è Brink, HG. Applicazioni è strategie d'immobilizazione di laccasi chì cuntenenu rame; una rivista. Heliyon 9, e13156 (2023).